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卵黄抗体的作用与制备
  • 发布日期:2022-07-05      浏览次数:2584
    • 卵内储存的营养物质,主要由清蛋白、球蛋白、磷蛋白、卵磷脂及一些酶等组成,在胚胎发育过程中起着积极作用。鸟类、两栖类和大多数鱼类的卵黄发生有两种来源:一是由卵母细胞本身合成,称内源性卵黄;一是由卵母细胞以外的组织细胞合成,称外源性卵黄,如脊椎动物由肝脏合成卵黄前体,再输送至卵巢,由卵母细胞摄入。 

      作用

      通过免疫注射产蛋鸡,即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体,并可用于相应疾病的预防和治疗,这类制剂称为卵黄抗体。卵黄抗体在临床上应用较为广泛,其优点是鸡蛋比动物血清更容易获得,且卵黄中抗体含量较高。禽类的免疫器官法氏囊主要控制机体的体液免疫,机体的免疫应答发生后,体液中成熟的骨髓依赖性淋巴细胞受相关免疫信号通路的介导,分化为浆细胞,随即产生大量抗体释放入血液中。血液中的大量抗体逐渐转移入卵黄中,并适量地蓄积。收集到的卵黄抗体,即为通过同一抗原反复刺激后产生的多克隆抗体。卵黄中主要的免疫球蛋白为IgY,其功能与作用类似于哺乳动物血清中的IgG。鸡lgY的分子量约180k Da,由两条轻链和两条重链组成,分子量分别为60~70k Da和22~30k Da,等电点约为5.2。IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶解能力。

      卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪,其比例为1:2。大部分蛋白质都是脂蛋白,存在于卵黄颗粒中,不溶于水,只有卵黄球蛋白(α、β、γ)是水溶性的,而IgY是γ卵黄球蛋白。因此lgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类,从水溶性蛋白中分离IgY。目前已建立了诸如PEG、硫酸葡聚糖、天然胶,如海藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

      实验材料

      1.健康产蛋鸡(最好是SPF鸡)、免疫抗原(如鸡新城疫灭活疫苗)、弗氏佐剂。
      2.灭菌生理盐水或0.01mol/L pH7.2 PBS、海藻酸钠、饱和硫酸铵等。
      3.毛细滴管、注射器、碘酊棉、酒精棉、烧杯、玻璃棒、离心管、pH试纸等。
      4.微量振荡器、离心机、分光光度计等。

      操作方法

      1.实验动物的选择:选择健康、产蛋率高的蛋鸡,购进后饲养1周左右,观察其健康情况。
      2.抗原的准备:免疫抗原有多种选择,一般采用灭活的病原体,也可以选择激素类、蛋白类物质,使用前可以选用弗氏*佐剂乳化抗原。
      3.动物免疫:免疫方式主要有口鼻接种、皮内接种、皮下接种、肌肉注射、腹腔注射以及静脉注射。禽类的免疫方式多用肌肉注射,接种中采用胸肌多点注射。使用弗氏*佐剂充分乳化抗原。以商用鸡新城疫灭活苗免疫为例,首.次免疫的剂量可以控制在1~2 mL,抗原含量为0.3-0.5 mg/kg(30日龄的蛋鸡免疫剂量为0.4 mg/次)2周后进行2次免疫,4周后第3次免疫之后每隔1个月可加强免疫1次。
      4.免疫鸡血清抗体效价检测:一般使用琼脂免疫扩散实验检测免疫鸡血清中的抗体效价。将免疫蛋鸡所用的抗原滴加于抗原孔,免疫鸡血清滴加于抗体孔。抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线者,为阳性。最高稀释倍数血清孔出现沉淀线,即为该血清的抗体效价。一般效价达到1:64以上时,可开始收集免疫蛋鸡所产鸡蛋。
      5.收集卵黄抗体:先用清洁水洗去蛋壳表面的粪污,再使用碘酊和酒精消毒。无菌条件下打开胚壳,倾出蛋黄至灭菌大烧杯中,以1:9的比例加入灭菌生理盐水或0.01 mol/L pH7.2 PBS稀释并充分混匀,调节pH至5.2,匀浆后的卵黄抗体可以进一步提纯,也可加入0.01%硫柳汞或每毫升卵黄液加入青.霉素、链.霉素各1000单位进行防腐抑菌,摇匀后分装于消毒好的瓶中,冷冻干燥保存或制成干粉利用。

      6.IgY的纯化:卵黄混合液反复冻融3次,6000 r/min离心30 min,分离出卵黄蛋白,加入终浓度0.07%的海藻酸钠和0.02%的NaCl,振荡,使海藻酸钠充分溶解,静置30 min,6000 r/min离心30 min,上清液调节pH到7.2,再依次用50%、33%、3%的饱和硫酸铵(pH 7.2)提取IgY,用 SephadexG-25脱盐。

      结果判定

      对获得的卵黄抗体进行的效价及活性测定,可采用免疫电泳实验、琼脂免疫扩散实验、血凝抑制实验、酶联免疫吸附实验等多种抗体检测方法。


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