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蛋白免疫印迹技术的步骤,分为哪五大步?
  • 发布日期:2023-08-08      浏览次数:534
    • 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测,可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。

      基本步骤:
      蛋白免疫印迹技术可以分为样品制备、电泳、转膜、免疫杂交五个步骤。
      一、样品制备
      对于Western Blotting实验而言,样品处理是关键步骤之一,获得的蛋白样品必须均质、可溶,并解离成单个多肽亚基,且尽量减少相互间的聚集,使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。 当目标蛋白的含量很低时,需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器(如核抽提物),或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。

      二、电泳
      将制备好的蛋白样品加入上样缓冲液(loading buffer),沸水煮5min。上述操作过程是为了破坏肽链间的二硫键以及蛋白分子的电荷,使蛋白质的迁移率不受蛋白质原电荷和形状的影响,而只取决于蛋白分子量的大小。上样针上加蛋白样品,在电泳缓冲液中,蛋白样品经浓缩胶凝缩后,在分离胶中按照分子量大小进行迁移,分子量小的蛋白分子迁移速率快,大分子的蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,从而实现分子的分离效果。

      三、转膜
      蛋白电泳结束后,将胶条根据待检目标蛋白切至合适大小,等比例准备硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜(使用前需在甲醛中浸泡),转移膜孔径的大小根据待检测蛋白的大小选择,大于20kD的蛋白可用0.45mm的膜,小于20kD的蛋白用0.2mm的膜。然后装配三明治夹心模型:海绵--三层滤纸--胶--膜--三层滤纸--海绵,放好后,排除各层之间的气泡,固定好夹子,按固定方向将其放置在转移槽中(保证胶中的蛋白能从胶转移至膜上,从负极向正极移动),转移槽置于冰浴中,防止由于电转移时产热造成的电阻过大,影响转移效率。

      四、封闭
      在进行抗体杂交之前,需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭,防止免疫试剂的非特异性吸附,从而降低背景,增加灵敏度,提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和 BSA(稀释于不同的缓冲液中),但不同的抗原-抗体反应,封闭条件均不相同,没有适合所有系统的封闭液,具体封闭条件(包括封闭液浓度、缓冲液种类、封闭时间、温度等)需自行优化。

      五、免疫杂交
      转膜结束后,将膜放至封闭液中(10%脱脂奶粉或1%FBS),室温摇床上孵育1h。TBST漂洗3遍×10min,然后将膜放入按固定比例稀释的待检测蛋白抗体中(一抗),室温孵育1h或4°C放置过夜。TBST漂洗3遍×10min,加入辣根过氧化物酶偶联的二抗,室温摇床上孵育1h。TBST漂洗3遍×10min,加入化学发光液,避光显色,显色时间根据蛋白条带出现时间确定。

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