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如何用TRIzol提取RNA
  • 发布日期:2023-08-01      浏览次数:445
    • 试剂配制和准备
      1. DEPC水或RNase free水;
      2. 75%乙醇(现配后预冷):用无水乙醇和DEPC水配制(DEPC水:无水乙醇=1:3),然后放4℃备用。1.5mL DEPC水+4.5mL无水乙醇;
      3. 异丙/醇:棕色瓶;
      4. lv仿:棕色瓶;
      5. Trizol:存放于4℃。

      RNA抽提
      1. 匀浆:在通风橱中往含有组织块的EP管中加入TRIzol和磁珠(组织100mg+1ml trizol +2颗研磨珠)。
      2. 研磨:设置研磨时间和频率,一般卵巢组织为65HZ,120s;随后可以继续实验或者冻存在-80℃。
      3. 轻柔颠倒混匀10下,室温孵育5min。
      4. 在通风橱中加入lv仿1/5 trizol体积(0.2ml)。
      5. 轻柔颠倒混匀15s,室温孵育2~3min。
      6. 4℃下离心,12000g,15min;观察液体分层:底层—红色酚-lv仿相;中间层—粉红色的交界相;上层—无色液相,即RNA层。
      7. RNA分离:用移液枪将上清转入新的1.5mlEP管中(预估上清的容积,大约500μL,调好移液枪),加入0.5ml(与样品上清等量)异丙醇,盖紧后颠倒混匀后室温静置10分钟。
      8. 4℃下离心,12000g,15min;小心弃去上清(倒去管中液体,残留液体用枪头在管口吸掉液体),注意底部的乳白色沉淀物即为RNA。
      9. 往沉淀中加1ml 75%的乙醇(用DEPC水或RNase free水现配,预冷),颠倒混匀洗涤RNA沉淀一次。
      10. 4℃下离心,12000g,5min。
      11. 用移液枪小心弃去上清(倒去管中液体,残留液体用枪头在管口吸掉液体),置于超净台上吹干10-15min,让乙醇挥发。注意:不能太干,肉眼观察管壁和管底见得到的液体消失后即可,此时RNA沉淀稍变透明。注意不能让RNA沉淀干燥。勿开紫外;室温吹干不可太长,RNA易降解。
      12. 在管中加10~20ul DEPC水或RNase free水溶解,37℃水浴锅温水浴10min,使RNA溶解。
      13. 测浓度评估提取的RNA质量:A260/280在1.8-2.0之间;A260/230在2.0左右;A260在0.1-1之间。
      14. RNA的保存:提取的RNA保存于-80℃超低温冰箱中,最好立即反转录以cDNA形式保存于-20℃冰箱。

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