1) 引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

2) 循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。

3) 酶的用量偏高或酶的质量不好。应降低酶量或调换另一来源的酶。

4) 退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

5) 样品处理不当。

6) Mg2+浓度偏高。因适当调整Mg2+使用浓度。

7) 若为PCR试剂盒。也可能时试剂盒本身质量有问题。

8) 复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

9) 反应缓冲液未*融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化*并*混匀。

10) 引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

11) 引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

12) 模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。

13) 外源DNA污染。确保操作的洁净。