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谷胱甘肽的检测手段
  • 发布日期:2023-01-11      浏览次数:1919
    • 谷胱甘肽检测方法较多,比较常用的有碘量法DTNBEllman试剂)亚硝基铁氰化钠法荧光法四氧嘧啶法高效液相色谱法 HPLC)。上述方法各有优点,在检测GSH含量时可根据实际情况,选择适合、灵敏、精确的检测方法

      DTNB比色法

      原理:DTNB与谷胱甘肽的巯基反应生成黄色的5 - 硫代 - 2 - 硝基苯甲酸,在412 nm波长处有最大吸收峰,而DTNB在400nm以上几乎没有吸收峰。向含有谷胱甘肽的试样中加入少量的DTNB,将反应液在412 nm处测定吸收值,根据吸收值的大小即可求得谷胱甘肽含量。

      方法步骤:

      1、DTNB贮存液配制:将0.01 mol/L的DTNB溶解于0.05 mol/L的磷酸缓冲液(pH7.0)中形成DTNB贮存液。

      2、DTNB分析液配制:将DTNB贮存液用0.5 mol/L、pH8.0的Tris - HCl缓冲液稀释100倍,配成DTNB分析液,避光放置,现配现用。

      3、操作步骤:取谷胱甘肽标准品溶液或待测样品溶液(0.1 ~ 3.0 mol/L)0.5 mL,加入到1.5 mL浓度为0.15 mol/L的NaOH溶液中,再加入3%的甲醛溶液05mL,在pH8.0、25℃下反应2 min,反应结束后,取反应液0.5 mL加入DTNB分析液,在25℃下反应5 min,于波长412 nm下测定吸收值。根据两者的吸光度,计算差值,代入标准曲线,计算出谷胱甘肽的含量。

      碘量分析法

      原理:利用谷胱甘肽的还原性与碘酸钾进行反应,当谷胱甘肽wanquan反应时,碘酸钾将碘化钾氧化为碘,碘使淀粉指示剂变成蓝色,即为滴定终点。

      操作步骤:精确称取谷胱甘肽样品0.05 mg,放入10 mL烧杯,用2%的HPO3溶解,移入100 mL容量瓶,用水定容至100 mL。吸取上述溶液5 mL放入100 mL 三角瓶内,再加入2% HPO35 mL使之成为10 mL,然后向其中加入5%碘化钾1 mL及淀粉指示剂2滴。采用0.001 mol/L的碘酸钾滴定,以消耗0.001 mol/L碘酸钾的数值与理论值2.445 mL一致时,则成品中谷胱甘肽含量为100%。

      计算公式中,V-消耗0.001 mol/L碘酸钾的体积(mL),2.445 -100%含量应消耗的体积(mL)。

      高效液相色谱法

      原理:高效液相色谱法是由于溶质在同定相和流动相之间的分配系数、亲和力、分子大小、吸附能力等不同,而进行连续分离的过程。

      操作步骤

      ①色谱条件

      色谱柱:Kromasil C18柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)。

      流动相:磷酸二氢钠和辛烷磺酸钠混合溶液(磷酸二氢钠3.0 g、辛烷磺酸钠1.0 g,加水溶解并定容至500 mL,用磷酸调溶液pH为3):乙腈 = 96:4(体积比)。

      检测波长:210 nm,流速0.8 mL/min,柱温30℃,进样量10UL。

      ②制作标准溶液

      准确称取谷胱甘肽标准品适量,用去离子水溶解于容量瓶中,混合均匀,定容,制成25 μg/mL、50 μg/mL、100 Vg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL系列浓度样品液,作为标准溶液。

      ③样品制备

      准确称取谷胱甘肽样品,加去离子水,混合均匀,制成浓度为25 ~ 800 μg/mL的样品溶液,作为分析溶液。

      ④绘制标准曲线

      将配置的谷胱甘肽标准液,分别吸取10 μL进样测定,以谷胱甘肽谷胱甘肽生产技术浓度和峰面积绘制其标准曲线,根据标准曲线得出该曲线的回归方程。峰面积的变化应与谷胱甘肽的质量浓度呈线性关系,其拟合度应达0.9995以上。

      ⑤样品的测定

      取谷胱甘肽样品分析液10 μL,用高效液相色谱仪进样测定,得到样品溶液的峰面积,根据回归方程计算出谷胱甘肽的含量


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