产品展示
PRODUCT DISPLAY
技术支持您现在的位置:首页 > 技术支持 > 影响PCR反应的五大要素
影响PCR反应的五大要素
  • 发布日期:2022-09-30      浏览次数:1149
    • 影响 PCR 反应的五要素:

      1、引物

      引物是 PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板 DNA 序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。

      设计引物应遵循以下原则:

      ①引物长度: 15-30bp,常用为 20bp 左右。

      ②引物扩增跨度: 以 200-500bp 为宜,特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。

      ③引物碱基:G+C 含量以 40-60% 为宜,G+C 太少扩增效果不佳,G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 蕞 hao 随机分布,避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

      ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别是 3'端的互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异的扩增条带。

      ⑤引物 3'端的碱基,特别是蕞末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。

      ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最 hao 有适宜的酶切位点,这对酶切分析或分子克隆很有好处。

      ⑦引物的特异性:引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量:每条引物的浓度 0.1~1umol 或 10~100pmol,以蕞低引物量产生所需要的结果为好,引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体的机会。


      2、酶

      目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应, 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶,另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。


      3、dNTP

      dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0~7.5,小量分装, -20℃ 冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。

      在 PCR 反应中,dNTP 应为 50~200umol/L,尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时 (偏高或偏低),就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合,使游离的 Mg2+浓度降低。


      4、模板

      模板核酸的量与纯化程度,是 PCR 成败与否的关键环节之一,传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶 K 能水解消化蛋白质,特别是与 DNA 结合的组蛋白,再用有机溶剂酚与 lv 仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。
      一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法,要防止 RNase 降解 RNA。


      5、Mg2+浓度

      Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显着的影响,在一般的 PCR 反应中,各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时,Mg2+浓度为 1.5~2.0 mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。


    联系方式
    • 电话

      400-0918-500

    • 传真

    在线客服