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琥珀酸脱氢酶的提取与测定
  • 发布日期:2022-08-23      浏览次数:977
    • 琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,简称SDH),黄素酶类,属于细胞色素氧化酶,是TCA循环中唯.一一个整合于膜上的多亚基酶,在真核生物中,结合于线粒体内膜,在原核生物中整合于细胞膜上,其是连接氧化磷酸化电子传递的枢纽之一,可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子,为线粒体的一种标志酶

      提取

      琥珀酸脱氢酶的提取与生理意义

      琥珀酸脱氢酶存在于所有有氧呼吸细胞,和线粒体膜牢固结合,是三羧酸循环中唯.一与内膜结合的酶,是脱氢酶中最重要的酶。迄今为止,已从多种原核和真核组织中分离纯化出这种酶,为该酶的酶学研究奠定了基础。作为膜内酶,琥珀酸脱氢酶与具有脂双层结构的线粒体膜结合得比较紧密,很难溶解下来,而且其一旦离开膜后,暴露在空气中会很快失活,因此其提纯难度很大。1950年我国著名生物化学家王应睐、邹承鲁、汪静英等开展对膜蛋白琥珀酸脱氢酶的研究,经过反复实验最后以正丁醇抽提法成功地把琥珀酸脱氢酶从鼠肝组织线粒体膜上溶解下来,得到了高纯度的水溶性琥珀酸脱氢酶,其活力比同期国外报道者高出1倍以上,从而奠定了我国在琥珀酸脱氢酶研究领域的领.先地位。其后,Davis等(1971、1977)使用NaClO4从牛心线粒体溶解下此酶;TsukahoHattori和TadashiAsahi(1982)选用离子型去垢剂脱氧胆酸钠从番薯根线粒体提取SDH;Suraveratum等(2000)对恶性疟原虫的琥珀酸脱氢酶进行了纯化;夏玉凤等(2000)以玉米黄化苗为生物材料,通过差速离心获得线粒体,使用超声波将其破碎,用2%TritonX-100溶膜,超速离心,硫酸铵沉淀,DEAE-C32层析纯化琥珀酸脱氢酶;辛明秀等(2004)用常规酶学方法从嗜冷酵母(Y18)中分离纯化出有催化活性的琥珀酸脱氢酶。
      琥珀酸脱氢酶是直接连在电子传递链上的,氢受体是FAD而不是NAD+,它使琥珀酸氧化为延胡索酸过程中所产生的FADH2与酶结合,将来自FADH2的两个电子直接传递给酶的Fe3+。现有研究表明,琥珀酸脱氢酶由α、β两个亚基组成,α亚基相对分子质量为70.0×103,含有FAD和两个铁硫簇;β亚基相对分子质量为27.0×103,含有一个铁硫簇。

      测定

      琥珀酸脱氢酶活力测定方法主要有五种。

      硫酸甲酯吩嗪(PMS)反应法
      琥珀酸脱氢酶能通过一系列人工电子受体,如与PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐),DCPIP(2,6-二氯酚靛酚)等发生反应催化琥珀酸的氧化,而借助这些中间产物的颜色变化,通过分光光度计检测即可加以定量反映,其反应式为:①Succinate+PMS→Fumarate+PMSH2;②PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2。DCPIP呈蓝色,标准的吸收光谱在600nm处,这种色泽可因其还原而渐次变淡,从而600nm处的光密度的变化与DCPIP含量成正比,测定2.6-DPIP的还原速度可以推算出SDH的活力。一分子DCPIP被还原,即代表一分子琥珀酸被氧化。故可测定此反应系统在600nm处的吸收光度变化,来计算SDH的活性。SDH活性计算:(标准-测定)/标准=μmol/min/mg。
      铁氰.化钾[K3Fe(CN)6]还原法
      以铁氰.化钾[K3Fe(CN)6]和琥珀酸钠为底物,使琥珀酸脱氢酶催化反应将铁氰化.钾还原为亚铁氰.化钾[K4Fe(CN)6],K4Fe(CN)6再与Fe3+作用生成普鲁士蓝,在700nm波长测定吸光值,以检测普鲁士蓝之生成量,作为琥珀酸脱氢酶的还原力,吸光值愈高表示琥珀酸脱氢酶活力愈强。
      TTC(氯化三苯四氮唑)法
      无色TTC(2,3,5-氯化三苯基四唑)作为人造受氢体,它在细胞呼吸过程中接受氢,还原成三苯基甲膳(TF)。后者以红色晶体的形式存在于细胞内,采用有机溶剂(如甲苯、乙.酸乙醋、三.氯甲烷、丙酮或乙醇等)进行萃取。萃取液测定485nm吸光度后,以TTC还原量表示脱氢酶活性,根据标准曲线计算TF生成量,进而求出TTC-脱氢酶活性。
      MTT法
      MTT是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT,同时在细胞色.素C的作用下生成蓝色(或蓝紫色)不溶于水的甲臜(Formazana),经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下,甲臜生成量与活细胞数成正比,因此可根据光密度570nm处OD值推测出活细胞的数目。
      NBT(氯化硝基四氮唑蓝)法
      NBT易溶于水,呈淡黄色,以NBT为受氢体,接受由琥珀酸钠盐被酶作用而脱下的氢,进而形成紫蓝色的沉淀,于反应体系中加入PMS,混匀,37℃保温30min,之后加入TCA终止反应。加异丙醇溶解显色,混匀,即可于548nm测OD值。规定:30min内548nm下OD值为1.0时的酶量为1个活力单位。比活力=活力单位数/毫克蛋白。


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