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细胞冻存与复苏操作步骤与注意事项
  • 发布日期:2020-04-07      浏览次数:2590
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      细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。 

      一、原理

      在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
      细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。

      目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。

      二、细胞冻存与复苏操作步骤

      (一)冻存 

      1、消化细胞(同实验二),将细胞悬液收集至离心管中。
      2、1000rpm离心10分钟,弃上清液。
      3、沉淀加含保护液的培养,计数,调整至5×106/ml左右。
      4、将悬液分至冻存管中,每管1 ml。
      5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂。
      6、贴上标签,写明细胞种类,冻存日期。冻存管外拴一金属重物和一细绳。
      7、按下列顺序降温:室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→低温冰箱(-30℃ 1小时)→气态氮(30分钟)→液氮。
      注意:操作时应小心,以免液氮冻伤。液氮定期检查,随时补充,不能挥发干净,一般30立升的液氮能用1~1.5月。

      (二)复苏 

      1.  细胞实验室进行常规消毒,紫外照射40min以上。
      2.  培养液(DMEM)、0.25%胰蛋白酶(Trypsin)恒温水浴箱37°C预热20min,备用。
      3.  二甲基亚砜(DMSO)在40°C冰箱中冷藏30min,备用。
      4.  从液氮保存罐中取出冻存管,立即放入400°C水浴中,快速摇晃,直至冻存液*融化。
      5.  将细胞悬液移入15ml离心管,缓慢加入4ml培养液,离心(1000r/min,5min)。
      6.  用培养液悬液混悬沉淀细胞,调整细胞浓度,方培养箱中培养。
      7.  记录复苏日期。
       
      三、注意事项

      1.  取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。

      2.  冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜(DMSO)对细胞不是*无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作 较大,因此,必须在1-2min内使冻存液*融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜(DMSO)选择进口产品。

      3.  离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。

      4.  离心问题:目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养,第二天换液。因为离心的目的是两个,去除 DMSO,去除死细胞,这个是标准流程,但对一般人来说,把握不好离心转速和时间,转的不够活细胞沉底的少,细胞就全被扔掉了,转过了活细胞会受压过大, 死亡。此外在操作过程中容易污染,所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜(DMSO),DMSO对细胞有一定的毒副作用,所以须将离心后的液 体前倒净,且一定倒干净。我在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏,结果无有异常。

      5.  细胞贴壁少的问题:教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml-15m培养液,而在我的试验中的经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

      6.  复苏细胞分装的问题:试验中我的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中,分装过多,细胞浓度过低,不利于细胞的贴壁。

      7.  加培养基的量放入问题:这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度,从如果你加培养基的太少,那么DMSO的浓度就会比较大,就会影响 细胞生长,从以前的资料来看,DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响,还有一个说法是1%。所以如果你的冻存液的浓度是 10%DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。

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